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Nella basilica superiore di San Francesco in Assisi (1228-1253) le grandi scene con le Storie del Santo, dipinte fra il 1290 e il 1300, riempiono tutta la fascia centrale della navata. Ciascuna delle scene misura 230 x 270 cm ed è dipinta ad affresco con ritocchi a secco quasi inesistenti (o perduti). La lettura delle scene inizia vicino all'altare lungo la parete destra, poi prosegue nella controfacciata e infine nella parete sinistra fino a tornare vicino all'altare. Vi sono raffigurati episodi della vita di San Francesco, dalla giovinezza alla morte e ai presunti miracoli postumi, con un'alternanza tra episodi storici ufficiali e leggende agiografiche.
Secondo i più recenti studi, il ciclo di Assisi si può suddividere in tre gruppi distinti: il primo e l'ultimo di sette quadri ciascuno, il mediano di sette coppie: 28 scene in tutto. Nel primo gruppo San Francesco è senza l'Ordine, nel secondo è insieme all'Ordine, nel terzo è l'Ordine che prosegue l'opera del Santo.
Con questo ciclo pittorico Giotto ruppe drasticamente con la pittura bizantina: niente più preziosismi fini a sé stessi, niente più oro, niente fissità da icona, niente arcane simbologie incomprensibili per la gente comune. La vita quotidiana tornò al centro delle attenzioni della pittura dopo essere stata esclusa dai cicli decorativi per secoli.