ПЦР REAL TIME ОТ и ДО понятными словами. Рекомендации к анализу. Выделяю ДНК Боррелии из клеща!

ПЦР переводится как полимеразная цепная реакция. Это прямой метод исследования, что означает, что мы ищем непосредственно патоген непосредственно там, где он
обитает. Как и в случае с бактериологическим посевом. Это означает, что взяв материал на исследование не оттуда, откуда надо, мы не
найдем патоген, даже если в организме он присутствует. При непрямом методе исследования, кстати, ищется нечто, указывающее на наличие патогена в организме, к примеру,
антитела. Например к той же самой боррелии - если к ней есть антитела, то человек, скорее всего, заражен. Итак, боррелию методом ПЦР мы ищем либо в клеще, а именно в его желудочно-кишечном тракте, либо в крови пациента. Но так как метод прямой, а его чувствительность начинается от 1000 бактерий в
1 миллилитре, то шанс не обнаружить боррелию в крови методом ПЦР довольно велик, поэтому врач обычно назначает сдачу антител к боррелии.
Сам метод полимеразной цепной реакции основан на механизме внутриклеточного удвоения ДНК с помощью определенного фермента - ДНК-полимеразы, потому и полимеразная.
Представьте, что у нас есть суп из разной ДНК, которая содержится
в клеще. Клещ будет фигурировать везде как пример, во всех других случаях происходит точно также. В супе из клеща присутствует ДНК клеща, ДНК человека, если клещ пил кровь,
ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые были частью жизни клеща. Так вот во всем этом супе нам надо найти именно ДНК боррелии. Для этого научно-коммерческие
лаборатории нашли участки ДНК боррелии, которые сугубо индивидуальны именно для нее и больше ни для чего. Обычно, они представляют собой отрезки, спаянные каждый в кольцо, где есть флюорофор и его гаситель. Таким образом, в исходном состоянии
такой зонд не излучает свечения. на первом этапе полимеразной цепной реакции нам нужно разделить все двухцепочечные ДНК в имеющемся "супе". Этот процесс называется денатурацией.
После денатурации наш суп полон одноцепочечных молекул. Мы снижаем температуру до той, при которой будет работать наш единственный фермент - термоустойчивая
ДНК-полимераза. После снижения температуры ДНК в супе стремится собраться обратно по закону комплиментароности. Вот тут то и вступают в игру искуственные зонды. При
наличии в супе участков, комплиментарных зонду, то есть принадлежащих боррелии, зонды разворачиваются и прикрепляются к таким участкам. Эта фаза называется отжигом.
При дальнейшем повышении температуры работает фермент ДНК полимераза, собирая зонды на местах их присоединения еще на пару десятков тысяч азотистых
оснований. Таким образом, на первом цикле у нас уже стало в 2 раза больше искомой ДНК чем было в начале. Эта стадия называется элонгацией.
Присоединенный развернутый зонд лишается гасителя флюорисценции из-за своего разворачивания и начинает испускать свет. Высокоточный оптический сенсор аппарата
регистрирует интенсивность свечения в конце каждого цикла.
Цикл повторяют от 40 раз, каждый цикл количество искомой ДНК возрастает в геометрической прогрессии, за это реакция называется цепной. В конце реакции мы видим
четкие графики нарастания флюорисценции, что говорит нам о наличии искомой бактерии или вируса. Если флюорисценции не наблюдается, мы получаем отрицательный результат.
Итак, вы сдали биоматериал по всем правилам. В данном случае - клещ. Если вы пришли снимать его к квалифицированному персоналу - они сделают все сами.
Если же вы вытаскиваете его сами, то положите его в какую-нибудь небольшую баночку. Он приходит ко мне и я готовлю из него суп.
После жестокой казни клещ подвергается не только механической обвалке, но и молекулярной. Мы начинаем процесс выделения ДНК из клеща. Клещевой суп наливается в лизирующий раствор и ставится в термостат на 65 градусов на 15 минут.
За это время соли уничтожат оболочки клеток клеща и бактерий, что позволит их содержимому вылиться в окружающий бульон. После этого я добавляю раствор для
преципитации, который свяжет освободившиеся нуклеиновые кислоты в осадок. В ультрацентрифуге на 14000 оборотов в минуту они пробудут 15 минут, осадок сконцентрируется
внизу пробирки. После этого с помощью медицинского отсасывателя надо удалить всякий шлак, оставляя осадок. Теперь осадок и пробирку надо отмыть, чтобы ничего не помешало
нашей ДНК-полимеразе работать. В этих наборах две отмывки. Спиртовая и ацетоновая. После каждый отмывки я удаляю всю жидкость, не задевая осадка. После последней промывки
нужно, чтобы весь ацетон был удален, по этому сушу осадок при 65 градусах 5 минут. После этого наливаю специальный растворитель осадка, чтобы у меня образовался чистейший
молекулярный супчик. Этот супчик и будет подвергнут дальнейшей полимеразной цепной реакции.

[@user-sh9dd6lx9q]

Наконец-то я сдал экзамены и смогу ваши видео посмотреть

[@life_form]

С успешной сдачей👍👍👍, приятного просмотра, спасибо)

[@andrejkoleno8384]

Отличная подача материала. Спасибо. Сделай видео о донорстве крови. С подачей материала в твоём стиле. Подними важную для общества тему. Удачи твоему каналу. Не забрасывай его. Тебя смотрят не только в России.

[@life_form]

Спасибо!) Когда нибудь обязательно сделаю, сейчас уже есть план видосов, просто приболел

[@user-rt5ex5wh9z]

Круто. Давай ещё про ПЦР, практики побольше.

[@user-jv6vl2og7k]

здравствуйте) спасибо за видео, только в пцр-смеси не азотистые основания, а нуклеотиды)) азотистые основания - это лишь часть нуклеотида)

[@user-nf4bd2gq5x]

Спасибо за видео, очень понятное объеснение, а запись самого проведения ПЦР это шикарно

[@user-ii9dk7gq8w]

за котов и подачу определённо лайк!

[@lilfuch2154]

чувак, продолжай, очень интересно

[@life_form]

Благодарю! А вы продолжайте ставить лайки, оставлять комменты и советовать видео своим друзьям. Это меня очень мотивирует.🤘

[@user-st3me5pb3f]

Классное видео👍👍

[@anastasionmed]

кайффф,прям очень понравилось просто о сложном!

[@user-wr9ej6cr9l]

Круто, очень полезное видео вы сделали👍👍👍 спасибо! и да, на счет тех ребят на кассе - это не от большого ума...

[@user-ys3nm7lc4p]

Круто объяснил!!! Молодчина😊

[@fimbulvinter4965]

Отличные видео по бак посеву и пцр, спасибо вам, помогают в учебе. Пожалуйста, продолжайте!

[@life_form]

Конечно буду, посоветуйте и своим одногруппникам, всем хорошо будет🤗

[@user-vp1ir1bh3g]

Класс! Спасибо большое! Вы образованный и очень умный человек:)

[@life_form]

Был бы умнее пошел бы в бизнесс ахахах. Так что есть и поумнее) но спасибо большое

[@user-vp1ir1bh3g]

@@life_form Каждому - своё в этой жизни. Настоящие профессионалы в любой области нужны. А Вы настоящий. Ещё и скромный:))

[@user-jv7qx7op5p]

приятно и интересно слушать!!! Спасибо огромное!

[@user-ye7fk1vt1g]

Спасибо за видео, все очень доходчиво пояснено) Было бы здорово услышать про способы добычи нуклеиновых кислот из разного биологического материала: клетки крови, эпителиальные и проч.

[@london7608]

Оставляю комментарий начав смотреть!

[@user-te1pl5is2t]

Спасибо большое!!!Информативно, доступно изложено и показано)))

[@life_form]

Спасибо за Вашу поддержку! Только это и мотивирует продолжать)

[@user-vs2he3jz2n]

Не поленилась и написала. Спасибо за подробное объяснение!

[@user-pt2pl7og4z]

Очень познавательно, интересно было посмотреть рабочий процесс))

[@life_form]

Так и работаем)

[@Alexxxtrazzz]

Профессионалам от профессионалов. Спасибо.

[@kartmanstone8377]

Спасибо большое!

[@irinapopova7373]

Спасибо, полезно!

[@user-xq4ff2zl6s]

Очень интересно.🧐 А насчёт челленджа полных тележок с продуктами ,глупо.🤣кто их вообще придумал🤣

[@life_form]

Дегенераты и придумали)

[@user-dj6cj1cz5n]

Очень круто

[@SurushKholiqov]

Спасибо! И дозаторы хорошие😂

[@user-gm9fm9pu3q]

Очень интиресно смотреть.

[@user-zc9xu5bp2p]

Спасибо за видео!

[@life_form]

Вам спасибо, что смотрите)

[@tammgatammga4186]

Ты как всегда хорош

[@life_form]

Все мы по-своему хороши)

[@user-pr2oc3wo5w]

Спасибо!))

[@sultankuat4261]

класс

[@london7608]

Спасибо за видео) Вопрос, сейчас в Инвитро есть анализы Гельмо-Скрин и Промо-Скрин, они методом ПЦР делаются. Собственно так на ваше видео и вышел, хотел узнать долго ли все циклы длятся? Т.е. какой минимальный срок проведения данного анализа. Заранее спасибо за потенциально возможный ответ.

[@life_form]

Мы тоже делаем это исследование. Сроки крайне расплывчатая штука. Само исследование длится около 5 часов, но срок выполнения зависит от загруженности лаборатории, количества исследований которое она выполняет и т.д. спасибо за идею, надо будет снять видос, в котором я расскажу почему есть сроки и от чего они зависят.

[@user-zx1vm7bt4i]

Супер

[@kaktus189]

Ты прикольный))

[@user-mh8oi2vh3i]

Спасибо, коллега, повеселил и научил студентов😂😅🎉

[@alexeyivanov5182]

Здравствуйте! Спасибо за материал! Вопрос: сколько по времени занимает последний этап амплификации, после погружения материала в аппарат? И можно ли делать амплификацию на одном и том же материале несколько раз?

[@life_form]

Выделенная ДНК хранится в морозилке. Сам процесс амплификации однократный. Но можно заново амплифицировать выделенные НК. Сама амлификация длится час-полтора.

[@alexeyivanov5182]

@@life_form т.е. например человек сдает пцр на что-либо. Выделяют днк и несколько копий помещают в морозилку на всякий случай?

[@life_form]

Выленная ДНК например находится в объеме 0.5 мл. На исследования, например, нужно по 5 мкл, это 0.005 мл. Копии - это результат амплификации, который мы узнаем в итоге. В исходнике после выделения у нас смесь всяких ДНК, из которых с помощью амплификации, мы узнаем то что нам нужно. Если выделенная ДНК закончилась, то из архива достается биоматериал исходный и выделение повторяют, чтобы провести дополнительные процессы амплификации

[@user-zx1vm7bt4i]

Крутяк

[@meamysterium8850]

Спасибо за видео! Как называется твоя должность?

[@life_form]

Врач КДЛ

[@meamysterium8850]

@@life_form а образование какое? :)

[@life_form]

Высшее медицинское и биологическое

[@vzlomshiks1]

👍

[@user-lp3ew8zt4h]

Комментарии для продвижения😂❤

[@Skipper24x7]

привет, я просто интересующийся из интернетов, я так и не понял, каким образом ставится положительный пцр? можно описать полный цикл простыми словами? к примеру есть условная "бактерия или вирус" как узнать что она есть в искомом материале? я так и не понял, я думал что есть какой то образец цепочки рнк или днк искомого вируса или бактерии и с ним сравнивается материал, а тут что то другое, или я что то не понял?

[@life_form]

Искомый участок ДНК "размножают" с помощью синтетической затравки, в которую вмонтирован химический светодиод. Если в биоматериала есть ДНК к которой подходит созданная искусственно "затравка со светодиодом", то после многократного цепного преумножения таких участков прибор регистрирует свечение, так как квантов света становится все больше, возрастает светимость образца на определенных длинах волн (зависит от вмонтированного "светодиода"). И получается положительный результат. Если к "затравке" не подходит ничего в биоматериале, то он просто не светится, результат отрицательный. Так как "светодиоды" включаются только после их встраивания в ДНК из биоматериала.

[@Skipper24x7]

@@life_form примерно понял, какая вероятность ложноположительного и ложноотрицательного варианта при таких исследованиях? и связаны ли они с человеческим фактором? может ли быть такое что в посеве есть "микроорганизм" а пцр на него отрицательный?

[@life_form]

Во всех лабораторных исследованиях ошибка может быть на всех этапах исследования. Для исключения таких ошибок ставятся всегда ВО ВСЕХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ заведомо положительный и заведомо отрицательные исследования. Также ошибки работы лаборантов при выполнении ПЦР контролируются так называемым внутренним контролем, синтетическая ДНК добавляется в биоматериал перед началом исследования и после всех манипуляций ищется на равне с искомым возбудителем. Только светится такой светодиод на другой длине волны и регистрируется отдельно. Таким образом правил но поставленная реакция ПЦР имеет точность 95% и специфичность на искомый патоген - 99.8%. Ложноотрицательные результаты связаны в основном с врачом, который берет биоматериал. Он может взять его так, что возбудителя там не будет. То есть это неправильный выбор очага инфекции или неправильная методика взятия биоматериала. Например, некоторые врачи ищут герпес 6 типа в крови, где он бывает в запущенных и тяжёлых случаях этой болезни (я обнаружил его в крови один раз за 10 лет практики ПЦР), а не из очага высыпания на коже, где вирус будет, что подтвердит диагноз. Такие пироги.

[@life_form]

@@Skipper24x7 отличные вопросы, спасибо, прям тепло на душе стало. Постараюсь оформить серию видосов о половых инфекциях в ближайшее время, прям мотивация появилась)

[@Skipper24x7]

@@life_form насколько я знаю сейчас современные тестовые системы у крупных компаний типа инвитро или хеликс автоматические и шанса на ошибку там нет?

[@user-mq2ji4tp5r]

маэстро

[@user-zn1me8nu4i]

Где можно купить днк реагенты для генетического тестирования на родство?

[@life_form]

Вам это никто не продаст в частные руки, так что нигде. И для этого нужно высокотехнологичное оборудование.

[@user-zn1me8nu4i]

@@life_form если я найду место где продают в частные руки вы сможете обьяснить что там к чему? Джо Роган снимал документалку про любительские лаборотории и угрозу биологического оружия. И Дима Побидинский снимал ролик про генные модификации со ссылками на реагенты

[@life_form]

Нет, не покажу. Причины я написал выше. Нескольких десятков миллионов на это у вас нет. Оборудование как бы. Да и зачем мне это?

[@london7608]

По поводу флешмоба это в каком регионе такое происходит?

[@life_form]

Да везде. Дегенератов хватает. Люди озлобленные. Только злость на слабых вымещают, только повод дай. Сильные то могут и без штанов оставить и ещё поднять пенсионный возраст🤣

[@RiderNambaLast]

Здравствуйте, врачи говорят, что тестировать клещей смысла нет, т.к. если даже клещ заразный то не факт что вы заразитесь. Я сдавал на 4 инфекции клеща, был живой, показало отрицательно по всем, включая энцефалит, насколько точно можно доверять пцр тестам? Читал что то около 98.5% и спасибо за инфу.

[@life_form]

Смысл в том, что если клещ "+", то будет наблюдать инфекционист и будут поставлены профилактические прививки. А по последнему - да, около того.

[@Maxx_Voodoo]

Ты про ПЦР или кассира в супермаркете??

[@vladimirmedvedev8908]

Почему мне кажется что 14000 это не ультрацентрифуга?

[@life_form]

Она самая

[@an.popova]

Господи, СПАСИБО ОГРОМНОЕ!!!!!!!!

[@Nickitos199]

!

[@Mason44]

флешмоб это тест на зомбированность и скудоумие.

[@life_form]

А ещё озлобленность и непонимание, что кассир просто пришел на работу и живёт на ней под приказами другого чела. И скорее всего просто не может найти работу, где ему не будут приказывать. В ВК были те, кто сравнивал этих кассиров с нацистами, типа те тоже выполняли приказы. Классная аналогия🤣🤣🤣

[@Maxx_Voodoo]

Половина материала вообще не поймёшь про что.. Про суть ПЦР вообще непонятно

[@user-wr1jh5jk3g]

Не впечатлило.. удачи!

[@user-lm6dv6io3k]

За подъем с днища

[@life_form]

Подъем с днища возможен только вами) я вроде как делаю что могу) Спасибо!

[@Rafail_Archangel]

👍

[@life_form]

🤜🤛