[New Western blot 2/6] 단백질용 젤 만들기(Polyacrylamide gel)

[@AbdifetahIOmar-zd6gh]

To be honest this is one of the easiest to understand video of western plot i have ever watched. thanks for putting the energy and sharing with us. I would like to request if you can attach detailed protocol here because its sometimes difficult to follow the English subtitle. all in all its 10 out of 10 bravo.

[@대학원생인것]

@@AbdifetahIOmar-zd6gh Oh, thank you so much. If it's okay, how about that I send you my protocol? I sometimes send my protocol to my subscribers if they want. 😊 Here's my E-mail, [e-mail] I hope you have a good day. Thanks again.

[@ddang0]

관련 내용이 전공과목인대요.. 1도 몰루갯어서 찾아보니까 이런 귀한 영상이.ㅜㅜ 감사합니다

[@대학원생인것]

감사합니다 ㅠㅠ 공부하시는데 도움이 되어 다행입니다.

[@Dnjeb]

마침 최근에 western blot 시작했는데 좋은 영상 감사합니다.

[@대학원생인것]

감사합니다 😆 다음 영상도 빠르게 올려보겠습니다! 🧑‍⚕️

[@inhaepark4566]

SDS page 실험 준비하고 있었는데 유익한 영상 감사합니다

[@대학원생인것]

감사합니다 ㅎㅎ 2부도 빠르게 올려보겠습니다 ㅠㅠ🥲

[@jojojo2301]

좋은 영상 감사합니다!❤

[@대학원생인것]

감사합니닼ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ🥰🥰

[@최최-r3u]

정말 감사합니다...

[@대학원생인것]

@@최최-r3u 감사합니다 🥰 좋은 주말 되세요 🙆

[@aunge9715]

안녕하세요 석사생으로 일하고 있는 학생입니다! ㅜㅜ 고수님께 질문 2가지만 남기고 가도 괜찮을까요? 1. 웨스턴 블롯을 하는데 계속해서 아령 모양이라고 할까 가운데가 가늘고 꼭 양쪽이 진한 그런 모양이 잡힙니다! 2. 스킴밀크를 몇 시간동안 잘 녹이고 믹싱을 해도 멤브레인에 꼭 검은 점들이 진하게 남아있습니다. 워싱도 열심히 하는데도요.. 부디 답글 주시면 정말 기쁘겠습니다! 영상 잘 보고 갑니다!😂

[@대학원생인것]

@@aunge9715 안녕하세요, 연구원님! 질문 주신 사항에 대해 답변 드리겠습니다. 1. 밴드가 아령 모양으로 되는 것은 여러 가지 이유가 있겠으나, 보통은 단백질 농도, 젤 로딩, 전기영동 조건에 문제가 있는 경우입니다. - 단백질 농도는 높은데 로딩하는 부피는 적은 경우, 양옆으로 몰리는 현상이 생깁니다. 저는 보통 1~2 ug/uL의 농도로 10 uL 이상 loading 하는 편입니다. - 전압이 너무 높을 경우, 또는 젤이나 버퍼가 과열됐을 때 나오기도 합니다. 100 V가 적당한 전압입니다. 바이오 래드 사에서는 200 V를 권장하지만, voltage를 반으로 낮추고 시간을 2배로 늘리는게 단백질에겐 좀 더 안정적입니다. 그리고 버퍼를 차갑게 만들어서 쓰시는게 좋구요. :) - 젤에 로딩하는 양이 너무 적으면 양옆으로 퍼지기도 합니다. 10-20 uL 정도를 로딩하시되, 천천히 주입해서 마치 바닥에 켜켜히 쌓이는 느낌으로 로딩해보세요. 훨씬 밴드가 이쁘게 나올 겁니다. - Stacking gel을 다 만드신 후에 well 내부에 남아있는 젤 찌꺼기를 잘 청소해주세요. 중간 부분에 젤 찌꺼기가 남아있으면 단백질을 양쪽으로 잘 퍼지게 만듭니다. 2. 멤브레인에 검은 점들이 보이는 건 보통 오래된 membrane, 부족한 blocking이나 높은 항체 농도에 의해 자주 생깁니다. 저도 간혹 오래된 membrane을 사용하면 까만 점이 나오는 걸 볼 수 있는데요. Membrane이 눌리거나 습기에 망가지면서 그 부분에 전기영동 중 단백질이 뭉쳐 막히는 거죠. Membrane을 한번에 많이 잘라놓고 사용하는 것 보다, 10~30장 정도 잘라서 항상 fresh하게 사용하시는 걸 추천 드려요. 그리고 blocking하실 때 skim milk의 종류, 농도와 처리 시간은 어떻게 되시나요? Skim milk도 western blot 용, 세균 배지용 등 종류가 다양합니다. WB용은 훨씬 입자가 고와서 버퍼에 잘 녹습니다. 저는 PBS 또는 TBS에 5%가 되도록 녹여서 사용합니다. RT에서 30-60 min, rocking하시는 걸 추천드립니다. 요즘처럼 추운 날씨에는 blocking이 좀 덜 될 수 있으니 따뜻한 연구실 내에서 하시는걸 추천드려요. :) 그리고 항체의 농도가 너무 높거나, ECL solution을 과하게 사용할때도 비슷한 문제가 생길 수 있습니다. 1차 항체 또는 2차 항체의 농도를 1:1,000~1:10,000으로 다양하게 처리해보신 다음, 몇 ug/mL의 농도로 처리해야 깔끔하게 나오는지 확인해보세요. 다음 WB부터는 해당 농도로만 걸어주면 문제 없습니다. ECL solution에 감광하신 후에는 휴지로 가볍게 여액을 흡수시켜 주시면 검은점(과포화 신호)을 없애실 수 있으실 거에요. ☺️ 이 외에도 궁금하신 점이 있으시면 [e-mail]으로 메일 주세요. 성심껏 도와드리겠습니다. 영상 봐주셔서 감사드리고, 좋은 밤 보내세요! 🙆🫶

[@aunge9715]

@ThisIsGraduateStudent 친절하고 자세하게 설명해주셔서 감사합니다! 정말 잘 보고 있어요! 감기 조심하시고 건강하세요!!

[@대학원생인것]

@@aunge9715 ㅎㅎ 감사합니다 🥹🫰

[@방구석음악단]

TEMED를 먼저 넣고, APS넣으시네요? TEMED넣으면 빠르게 굳어서 언제나 서둘러야 하는데, 이 비율대로 하면 침착하게 해도 되는건가요. GEL두개 동시에 만드는데도 전혀 막힘없고, 영상까지 찍을 수 있는 거군요.

[@대학원생인것]

@@방구석음악단 네, 맞습니다. TEMED는 APS가 젤을 polymerization을 하는데 조력자 역할만 할뿐 직접적으로 젤을 굳히진 않습니다. 가장 좋은 방법은 TEMED와 APS를 제외한 나머지 모든 재료를 섞고, 굳히기 전에 TEMED, APS 순으로 넣어주는 것이 맞지만, TEMED를 미리 넣어놓고 APS만 나중에 넣어줘도 괜찮습니다. :) 조금 더 팁을 드리자면, degassing이라고 해서 TEMED와 APS를 제외한 나머지 재료들을 섞고 진공 펌프로 시약 속 공기를 제거해주는 작업을 거쳐주면 더 좋습니다. 젤 내의 공기를 없애줄수록 아크릴아마이드 젤의 밀도가 한층 더 단단해지면서 결론적으로 이쁜 단백질 밴드를 검출할 수 있죠 😉

[@김도현-i8x]

좋은영상 감사합니다!

[@대학원생인것]

감사합니다 🥰🥰🙇

[@d.v.m]

1편에 이어 2편도 정말 잘보고 갑니다. 회사다니는 대학원생인데, 큰 도움되는 것 같아요^^ 혹시... 아직 5편까지 가지도 않았지만, 6편은 원래 어떤 내용 만드실예정이었나요. (그부분은 따로공부하려고요)

[@대학원생인것]

6편은 멤브레인을 찍고, 사진을 편집하고, 데이터를 해석하는 것까지 총망라해서 만드는 중입니다. 다만 실험과 해외출장 때문에 편집이 밀려있네요 ㅠㅠㅠ 죄송합니다.

[@d.v.m]

죄송하긴요. 전혀요ㅎㅎ정말 감사합니다~!!

[@대학원생인것]

@@d.v.m 감사합니다 ㅎㅎ 좋은 밤 보내세요 🥰

[@euuuz3751]

자세한 설명 정말 감사합니다!!ㅎㅎ 혹시 Running gel, stacking gel를 청소해줬을 때와 안해줬을때 차이가 큰가요?? 저는 계속 워시를 안하고 했었거든요ㅠㅠ

[@대학원생인것]

댓글 감사합니다 ㅎㅎ 워싱을 안해주면 웰 안 바닥이 간혹 찌꺼기 때문에 U 자모양으로 되어 있는 경우가 있습니다. 하지만 워싱을 제대로 깔끔하게 해주면 바닥이 |_| 이렇게 네모나게 돼서 조금 더 이쁜 밴드가 나오더라구요. 둥글둥글한 밴드냐, 직사각형의 깔끔한 밴드냐 그 차이라 큰 차이는 아닙니다만, 논문 쓸때 아시죠 그거 ㅋㅋ 아 피규어 좀만 더 이뻤음 좋겠다, 아 웨스턴 좀만 깨끗했으면 좋겠다 이런마음에서 하는거죠 ㅎㅎ 저도 석사 1년동안은 워싱하지도 않았습니다 ㅋㅋㅋ 괜찮아요

[@안녕하세요-l5e4q]

안녕하세요 이번에 웨스턴 블롯 실험을 배웠는데요 도무지 이해가 안가는게 있어서 질문 드립니다! 1. 로딩 과정에서 전압의 차이는 무엇을 의미하나요? 2. 로딩 시작후 기포가 생기는데 이 기포는 어떤 원소이며 역할이 무엇인지 너무 궁금합니다-!ㅜㅜ

[@대학원생인것]

안녕하세요!! 답변 드리겠습니다 ㅎㅎ 1. 전압의 차이는 전압이 셀수록 단백질을 빨리 분리가 가능하고 전압이 약할수록 단백질을 천천히 분리할 수 있습니다. 전압이 높을수록 단백질을 빨리 분리해서 시간을 절약할 수 있지만, 발열이 많이 생겨 단백질이 변성될 수 있습니다. Bio Rad사에서 권장하는 전압과 시간은 200 V, 35 min이지만, 단백질들마다 적절한 전압과 시간은 전부 다르니, 직접 실험해보시면서 기준을 잡아가시면 됩니다. :) 2. 기포는 용액에 전기가 흐른다는 의미입니다! 전해질 용액(버퍼)은 전기가 흐르면 그 안에 있는 공기가 기포 형태로 바뀝니다. 전압을 걸어주고 기포가 생기는걸로, 아 전류가 잘 흐르고 있구나 라는걸 알 수 있죠. 만약에 파워서플라이에서 run을 눌렀는데, 기포가 안 생긴다?? 그러면 전기가 흐르지 않고 있다는걸 의미하니, 뚜껑을 재결합하거나 전선이 끊겨있진 않은지 확인하셔야 합니다. :)

[@안녕하세요-l5e4q]

@@대학원생인것 빠른 답변 감사합니다!!!

[@대학원생인것]

@@안녕하세요-l5e4q 행복한 실험 되세요 😆

[@챔취-o6h]

실험은 언제쯤 잘하게 될까요...기기 하나하나 다루는것부터가 너무 긴장되고 망가뜨릴까봐 조마조마해서 인턴하는게 넘 쉽지가 않아요...사고칠까봐 넘 걱정이 많은 학부생인턴입니다..ㅠㅠㅠㅠ

[@대학원생인것]

아이쿠야 알람이 뜨지 않아서 이제 답을 드리네요 ㅠㅠ 인턴 생활 많이 힘드시죠? 학부생이라 아직 잘 모르겠는 것도 많고, 뭔가 조심스러워지고... 여기 학부참여생들도 비슷하게 얘기하더라구요. 제가 겪고 있는 상황이 아니라 왈가왈부 드리기 참 어렵지만, 인턴이나 실험실 참여활동이든 무언가를 도전하고 있는 사람에게는 항상 기회와 보상이 주어진답니다. 지금 방학때 놀면서 허송세월하는 사람도 있는 반면, 우리 챔취님처럼 열심히 일하며 건강한 걱정을 하는 노력파들도 있는 것처럼, 챔취님 학부인턴쉽 끝날때쯤엔 분명 노력하신만큼 얻어가시는게 존재할겁니다.

[@대학원생인것]

걱정하시는 마음 잘 이해합니다. 그래도 너무 긴장마시고 안전하게 실험, 인턴쉽 모두 잘 마치시길 바랍니다 😊

[@JY_Healing_Spot]

영상을 몇번이나 반복해서 봤지만 너무어렵네요...프로토콜을 공유 받을수있을까요....😢?

[@대학원생인것]

네네👌 [e-mail]으로 메일 하나만 주세요 😊

[@ryuviavii2867]

연구실에서 처음으로 인턴하게 됬는데... 피펫으로 버퍼 옭일때... 버퍼가 들어있는 통 뚜껑을 안채워서... 둘쩻날 출근에... 사고를 크게친 3학년 대학생입니다.... 코로나때문에 연구실에 한번도 들어가본적이없던 절... 받아주신 교수님께... 너무 쬐송하네요...곧 Western Blot도 알러주신다는데.... 많이 봐야겠어요... 실수... 절때하면 안된다아아 ㅠㅠ...

[@대학원생인것]

아이구야...토닥토닥 ㅠㅠ🥲 앞으로 실험은 잘 되시길 바랄게요 화이팅!!👍👍

[@ryuviavii2867]

@@대학원생인것 감사합니다아 ㅠㅠ... 혹시... 렙에서 초심자가 알면 좋은 팁같은게 있을까요? 영상보면서... 웰청소하시는 노련함을 보고... 눈이 쩌억....!

[@대학원생인것]

@@ryuviavii2867 꿀팁은 카톡이 더 낫지 않겠습니까 선생님 😆 메일 하나만 보내주세요! [e-mail] 선생님을 한번 알잘딱으로 개조해보겠습니다.

[@ryuviavii2867]

@@대학원생인것 허억.... 감사합니다!!!! ㅠㅠ

[@yerganat.h2497]

Wow awesome

[@대학원생인것]

Oh, good to see you again, Yerganat. I hope you and your wife to satisfy this video. I will upload next video as soon as possible. Best, thanks 😊👍

[@yerganat.h2497]

@@대학원생인것 thank you, I will wait you for next good video.

[@룰루-w3n]

자세한 설명 너무 감사해요ㅠㅠ 이해가 잘 됩니다! 조직을 잘라서 얼려둔 상태인데, 나중에 웨스턴 블랏을 한다는 이야기는 이 조직을 어찌 처리하고 웨스턴 블랏을 하게 되는 걸까요?!

[@대학원생인것]

웨스턴 블랏은 세포나 조직에서 추출한 단백질을 정성하는 방법이기 때문에, 조직에서 샘플이 되는 단백질 추출을 먼저 하셔야 할거에요. 조직을 호모게나이저를 사용해 세포 단위로 쪼개신 다음, 그 세포 덩어리에 lysis buffer를 처리하면 제가 영상에서 사용하는 단백질과 똑같은 걸 얻으실 수 있어요! 😁

[@룰루-w3n]

감사합니다❤️

[@대학원생인것]

@@룰루-w3n 넵 화이팅입니다 ☺️ 또 궁금한게 있으시면 언제든 질문 주세요 🥰

[@choigoyam]

아가로스젤은 만들기 진짜 쉬운데 웨스턴 블랏용은 상당히 복잡하네요.. 곧 실험하게 될 예정이라 많이 반복해서 봐야겠어요ㅠ

[@대학원생인것]

네네 단백질 용이 많이 까다롭죠 ㅠㅠ 단백질이 붕괴되기 쉽고 크기가 작으니 그만큼 섬세해야하는 거 같아요 ㅠㅠ 화이팅입니다!! 🙆😊

[@하재준-o4w]

gel 만들 때 선이 보이고 층이 나뉘는게 보이는간 자연스러운 현상인가용??

[@대학원생인것]

네 맞습니다. 먼저 굳고 그 위에 젤을 부으면, 경계 부분에 덜 굳은 젤, 울퉁불퉁한 표면 등으로 인해 자연스럽게 경계라인이 생깁니다. 성분 차이 보다는 시간 차이에 의해 생기는 자연스런 현상이며, running gel을 먼저 굳히고, 그 위에 또 같은 성분의 running gel을 부어서 굳혀도 똑같히 선이 보입니다 ㅎㅎ

[@yeonju00]

Isopropanol 대신 DW나 PBST 써도 되나요..??

[@대학원생인것]

Isopropanol은 resolving gel보다 밀도가 낮아서 gel 위에 뜨기 때문에 눌러줄 수 있습니다. 하지만 DW나 PBST는 gel을 만드는 재료로 사용되기 때문에, 위에 떠서 층이 생기는 대신 아마 젤과 섞여버릴 겁니다. Gel의 용매가 DW이니까, 좀더 묽은 젤이 만들어지는 결과만 나올겁니다...!

[@yeonju00]

아아 그럼 메탄올은 될까요..??

[@대학원생인것]

@@yeonju00 연주님 딱 대...세요 지금 이소프로판올이 없으신거죠??? 급하게 대체품 찾으시는거죠????

[@대학원생인것]

메탄올은 젤 내에 있는 SDS를 없애는 역할을 하기 때문에, 절대 사용하시면 안 되고 알코올은 될지 모르겟네요 ㅠㅠ

[@yeonju00]

앗,,,맞습니다,,ㅠㅠㅠ답변해주셔서 감사합니다

[@Yeongjunchoiii]

SDS전에 BCA는 진행하지않으시나요?

[@대학원생인것]

보통은 잘 하지 않고 특수한 경우에만 합니다. BCA가 그렇게 정확한 기법이 아니기도 하고, 웨스턴 상에서 BCA 결과와 다르게 나오는 경우도 종종 있거든요. 🤔 게다가 저는 한 종류의 단백질을 주로 보는 편이라 이미 단백질 농도를 알고 있어서 더욱 하지 않는 편입니다. 세균에서 단백질을 정제하거나, 새로운 단백질을 탐색할때만 가끔씩 하는 편입니다 😄