[New Western blot 1/6] 단백질 제작하기(Protein harvest)

[@Chibidana]

Wonderful I totally enjoyed your video and how you work in detail 😍

[@대학원생인것]

@@Chibidana Oh, thank you so much 🥰 I still need to do much harder. If you need some help, please let me know. Have a good day 🙆

[@하부각]

오늘도 잘 보고 갑니다! 제가 한 과정이랑 비교해서 보니까 복습되고 너무 좋아요! 영상 감사합니다!

[@대학원생인것]

감사합니다!! 😆🙇

[@d.v.m]

정말 감사히 잘봤습니다 선생님^^

[@대학원생인것]

감사합니다 선생님 😁🥰

[@geunah5874]

안녕하세요 !! 다양한 영상 올려주신 덕분에 도움을 많이 받고 있는 석사과정 학생입니다!! 혹시 phosphorylation level을 높이기 위해 pervanadate 를 사용해보신 적이 있으신지 궁금합니다 !!

[@대학원생인것]

안녕하세요! 제 영상이 도움이 되셨다니 다행입니다 😊 제가 보던 단백질들은 원래 양이 많아 따로 phosphorylation을 도와주는 물질을 사용해본적은 없습니다 ㅠㅠ

[@emmakwak1107]

잘 봤습니다아

[@대학원생인것]

@@emmakwak1107 감사합니다 ☺️ 좋은 주말 되세요 ㅎㅎ

[@user_7628]

선생님! 혹시 이메일로 질문 하나 드려도 될까요? 내용이 길어서요! ㅠㅠㅠ

[@대학원생인것]

@@user_7628 네네! [e-mail]입니다

[@erebus-p6i]

재밌게 보고있습니다! 근데 글씨가 좀 작은것 같아요!

[@대학원생인것]

감사합니다 😄 글자크기는 한번 좀더 키워보겠습니다!! ㅠㅠ 😯

[@youngjzy9934]

피펫인지 알았는데 석션이 된다니.. 뭘까요… 학부생이라 처음보는게 많네요!!

[@대학원생인것]

오 정확하게 보셨네요 ㅎㅎ 우선 저거는 serological pipet이 맞습니다. 정확하게 얘기하면 serological pipet'였던 것'이죠. 거의 모든 clean bench는 저런 suctioner (흡입기, 석션 이라고 합니다)가 달려있는데, 저 호스의 끝에는 마치 진공청소기 역할을 하는 모터가 달려있습니다. 모터로 이어진 호스 중간중간마다 비커가 있는데, 그 비커에 석션한 액체들이 모이게 되죠. 물론 액체가 많이 쌓이면 유기계 폐액으로 따로 처리합니다. 잘 보시면 serological pipet 앞에 마이크로피펫 팁을 끼워 놓았는데, 다른 세포 또는 다른 과정을 할 때 오염되지 않도록 팁만 간단히 빼서 버릴 수 있게 끼워둔 거에요. 만약 팁 없이 하면 석션할 때마다 알코올로 닦아주거나 serological pipet 전체를 갈아줘야 하거든요. 저렇게 간편하게 팁만 교체하면 되는 거죠. ㅎㅎ 궁금증이 풀리셨을까요?

[@youngjzy9934]

@@대학원생인것 와우..정성스러운 답변 감사드립니다.. 클린벤치에 저런게 있었군요.. 개인실험마다 사용하는데 있는지도 몰랐다니 제 스스로가 부끄러워지네요ㅎㅎ.. 실험하는 모습 항상 멋지다고 생각합니다!! 남은 하루 마무리 잘 보내세요~!

[@대학원생인것]

@@youngjzy9934 아마 단순작업용, 세균작업을 하는 클린벤치는 없을 가능성이 높긴 합니다! 따뜻하게 말씀해주신 점 감사드리며, youngjzy님도 남은 하루 잘 보내시길 바랍니다 ㅎㅎ 🙇

[@inhaepark4566]

유익한영상 감사합니다 혹시 세포Viability 측정할때 사용되는 srb assay kit 사용해보셨나요?

[@대학원생인것]

감사합니다 ㅎㅎ srb assay는 처음 들어보네요. 저는 MTT assay 또는 cell counting으로 viability를 측정합니다 ㅠㅠ

[@이주연-o3n3b]

RIPA bf protocol을 찾아보면 다 조금씩 달라서 헷갈렸는데 이 영상보고 확실히 알겠네요! 감사합니다 하나 여쭤보고 싶은게 있는데, western 하기 전에 protein 농도를 재봐야하는 것으로 알고 있는데 RIPA bf로 뽑으신 protein은 어떻게 측정하시나요? 정확히 기억이 안 나는데 RIPA로는 BCA로 재면 안된다고 하더라고요

[@대학원생인것]

제가 평소에 보는 단백질이 E-cadherin이라고 워낙 차고 넘치는 단백질이라 저는 대충 만들어도 항상 GAPDH가 차더라그요. 그래서 평소에 단백질 정량을 하진 않는데, 굳이 한다면 BCA를 주로 합니다. 지방이 많은 단백의 경우 Lowry법을 주로 하고, 그냥 단백이 있나 없나 볼때는 별로 정확하지 않지만 간단하고 값싼 Bradford법을 사용합니다 ㅎㅎ RIPA lysis buf를 BCA에 사용할 수 없다는 건 제가 잘 안하는 실험이다 보니 잘 모르는 듯 합니다. 근데 일단 되긴 하더라구요 🤔 ㅋㅋㅋ

[@user-vk6si5xt6e]

안녕하세요! 선생님의 영상으로 큰 도움을 받고 있는 구독자입니다! 혹시 상층액을 suction시 cell이 너덜거리는 현상은 어떻게 개선해야할까요?ㅠ plate를 기울여서 최대한 media 만 살살 suction해보는데 항상 cell이 손상되어 고민입니다...! plate 바닥이 보일정도로 뜯어지는 건 아니지만 그래도 cell이 너덜거리는 게 실험에 영향이 갈 것 같아 신경쓰여서요..!ㅠㅠ

[@대학원생인것]

제 영상이 도움이 되었다니 다행입니다 ㅠㅠ 봐주셔서 감사합니다 ㅎㅎ 저도 가끔 상층액에 cell이 너덜거리는 경우가 있는데, 이 경우 suction을 이용해 상층액을 버리는게 아니라, 파이펫으로 상층액을 하나하나 덜어서 버려줍니다. 만약에 세포가 호로록 빨려올라오면 따로 튜브에 모아놨다가 다시 넣어주거나 하죠. 그런데 대개 떨어진 세포는 죽은 세포이기 때문에 세포수를 정확히 계산해야하는 실험이 아니라면, suction 돼도 큰 문제는 없습니다. :)

[@밍도비-e3h]

정말 잘 보고있어요ㅜㅜㅜ 오늘 60pi에서 단백질 추출을 했는데 정량하니 농도가 1.4밖에 안나와서,,,농도를 높게 뽑을 수 있을 팁이있을까요..? 다시 cell 풀기부터 해야하니 우울해요ㅜ

[@대학원생인것]

농도가 적게 나와서 우울하셨군요 선생님 ㅠㅠ 그 마음 이해합니다... 선생님 농도가 1.4라고 하셨는데, 추출하신 lysis buffer는 RIPA buffer인가요? lysis buffer 몇 uL에 추출하신건지, 농도가 1.4 ug/mL인건지, 단위를 부탁드립니다 😄 같이 차근차근 해결해봅시다 ㅎㅎ

[@밍도비-e3h]

허걱..ㅠㅠㅠㅠ답장 감사드립니다😭😭저의 실험실에 석사가 저밖에 없어서 혼자 브릭이랑 논문보면서 하고 있는데 쉽지 않네요..ㅠ60pi에 msc cell을 키우고 있어요! 현미경으로 관찰결과 80%정도는 자랐다고 생각을 하여 단백질 추출을 진행하였습니다. 맨날 조직에서 단백질을 뽑았는데 세포에서 뽑는건 처음해봐서 실험실프로토콜 대로 진행했습니다. 그 순서는 얼음위에 디쉬를 올려두고 뚜껑에 배지를 부어둔다음 배지500ul을 dish에 넣어 스크래퍼로 모은 후 15mltube에 넣는다. 그 후 다시 뚜껑에 버려둔 배지 500을 따서 dish에 넣고 다시 세포를 모은 후 1.5ml tube에 넣어둔다. 그 후 12000rpm으로 4도 3분으로 센트리 돌린후 상층액 버리고 pbs 1ml을 넣어 pellet을 wash한 후 다시 센트리 후 상층액 버림! 그 후 lysis buffer을 넣는데 제가 다른 실험실에서는 리파버퍼를 썼었는데 여기서는 10Xcell lysis buffer을 씁니다(사실 이 둘이 무슨 차이인지는 모르겠어요ㅠ) 10xlysis buffer 10xphoshatse 25X protease를 각각 100ul 100 40 씩 넣어 master mix를 만들고 100씩 따서 msc pellet을 pipetting으로 풀어줬습니다!!그 담 얼음에 1.5ml tube 옆으로 눕혀두고 20분 쉐이커해줬습니다(여기서 쉐이커 강도를 어느정도가 적당한가요? Tbst로 wash할때 강도인지 모르겠어요ㅠ) 그 후에12000rpm으로 7분 4도 센트리한 후 상층액만 땀!!!사실 이때도 선생님 유투브 영상처럼 debris가 많이 없어서 잘못된 건가 싶었지만 데브리즈가 별로 안 나타날 수도 있다해서 계속 진행했습니다! 그리고 정량을 했습니다. Bca를 1:49의 비율로 만든 후 96well에 200ul씩 넣고 bsa로 1,2,4,8ul씩 넣어주고 샘플은 1ul씩 넣어주었습니다! 그러니 r^값은 0.98666이 나왔고 단백질 농도를 계산했는데 하나는 0.5, 하나는 1.4ug/ml이 나와 도저히 웨스턴 내릴 양이 아니다 싶어서 멈췄습니다ㅠㅠ 그래서 낼 다시 stock 밖아 둔 cell을 풀어서 해볼 생각인데.. 어디에서 실수가 있었는지 잘 모르겠어요ㅠ 스크래퍼를 첨 사용해 그 과정에서 셀 손상을 일으켰다고 생각하는데 스크래퍼 말고 셀 손상을 덜 일으키면서 셀을 모을 방법은 있을까요..? 이번주부터 웨스턴 연습을 해야하는데 단백질 농도에서 이러니 넘 속상해여..😭

[@밍도비-e3h]

아..그리거 어떤 분은 1ml master mix를 만들떼 100ul,100ul,40ul넣은 후 남은 양을 dw맞춘다는데 dw을 넣는것인 맞나요..? 단백질 정량할 때 540흡광도로 진행하였습니다!

[@대학원생인것]

선생님, 상세한 설명이 필요할 듯 한데, [e-mail]으로 메일 하나만 보내주실 수 있나요? 메일로 답변 드리도록 하겠습니다!

[@대학원생인것]

선생님, 제가 지금 잠시 밖에 나와있어서 저녁 식사 이후 들어가는대로 답장 드리겠습니다 ㅠㅠ 많이 급하실텐데 죄송합니다. 잠시만 양해 부탁드려요 😊

[@Jhyeon-c1e]

complete mini를 보통 lysis buffer 10ml 1개 넣어서 사용했는데 20X는 어떻게 만드나요 보관은 -20에 하나요?

[@대학원생인것]

저희는 complete mini 1개를 1 mL에 넣으면 20X가 되는 disk를 사용합니다! 애초에 농축된 디스크(종이처럼 생김)를 사서 증류수에 녹여 쓰는 거죠. 보관은 말씀하신 대로 -20도에서 합니다 ㅎㅎ

[@Jhyeon-c1e]

@@대학원생인것 tablet 1개를 1ml에 녹이면 10X 아닌가요?

[@대학원생인것]

@@Jhyeon-c1e 저희는 1 mL에 녹이면 20X가 되는 제품을 사용 중입니다!

[@대학원생인것]

@@Jhyeon-c1e 저희는 예전에 선배께서 사두신 걸로 쓰는 중이라 요즘도 농축배수를 다양하게 해서 판매하는지는 모르겠습니다 ㅠㅠ