Northern Blot: Conceptos Básicos

[@rafaelnavarrouro5173]

excelente explicación resumida, te felicito, pondré tu video como explicación sobre el método de NOTHERN BLOT para mis alumnos. Saludos te ha comentado un ingeniero bioquímico

[@BrandonOrtizCasas]

Muchas gracias Rafael. ¡Espero les sirviera bastante!

[@cesardiaz154]

Muchas gracias por estos videos, me ayudaron mucho para mi recuperación de Ingeniería Genética. Saludos

[@chikizerotwo]

tus videos son continuamente usados en mi posgrado

[@BrandonOrtizCasas]

Me parece increíble que aún sin yo tener uno, se utilicen a ese nivel :)

[@josealejandromoraramirez5719]

Gracias Brandon, me ha sido de mucha ayuda para una tarea de la facultad, Saludos!

[@cristhianruiz5323]

Serias un buen docente adelante tienes un buen futuro con tu conocimientos

[@BrandonOrtizCasas]

¡Muchas gracias, amigo! Esperemso que pueda serlo en el futuro. Un abrazo.

[@harrisoncampos1745]

Muchas gracias por estos videos, son demasiado bueno, bien explicados y muy dinámicos! me han ayudado demasiado!

[@GabowtfCovers]

Gracias como siempre bro, siempre me sirven tus videos cuando no entiendo ciertas técnicas ty

[@ElianaBalt]

Hola Brandon! Excelentes videos. Doy la clase de biología molecular a chicos de licenciatura y les comparto tus videos para repasar el tema. Saludos y gracias!

[@BrandonOrtizCasas]

Muchas gracias! Espero que fueran útiles para tus alumnos

[@SirMorganD]

Tienes una buena voz, y todo esta bien explicado, hasta con paper, gracias.

[@sandrarodrriguez8539]

Excelente video como siempre.

[@clararequenadalessio2996]

super claro todo!! un genio

[@mariogr2882]

Más ciencia 🚬. Me voy aventar todos los anuncios para apoyarte

[@ImaneImane-ni9ov]

Muchas gracias por tus videos

[@adriangomez17]

Muchas gracias maestro!! Muy buen vídeo!!

[@antonioeduardo1098]

Muy claro, sigue haciendo tutoriales de técnicas bioquímicas

[@agostinamonegal77]

Nos re ayudaste a las chicas UB de Argentina a preparar la materia biologia molecular!

[@BrandonOrtizCasas]

¡Me alegra bastante el haber podido ayudarles!

[@davidlorenzoverdugoarmenta1944]

Excelente

[@agostinamonegal77]

Gracias Brandon genio!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

[@cristhianruiz5323]

Amigo eres excelente

[@anaruth4208]

Ótima aula! Parabéns!

[@BrandonOrtizCasas]

Muito obrigado!

[@samuelroldan2411]

Muchas Gracias.

[@focus4919]

graciassss

[@belenvillarroel9378]

Podrías hacer un video sobre las aplicaciones de los tipos de blots?

[@BrandonOrtizCasas]

¡Si!

[@DaniaFerrer-m1j]

cuando@@BrandonOrtizCasas

[@videosinformativos4447]

La sonda que se utiliza es de ADN ?

[@BrandonOrtizCasas]

Pueden ser tanto de DNA como de RNA; aunque algunos científicos recomiendan que sea de RNA, dado que las condiciones de su hibridación son más estrictas, dando así una mejor calidad de señal.

[@valentinacastano2883]

Hola me puedes ayudar por favor?? Necesito saber como se interpretan los resultados de esa tecnica

[@BrandonOrtizCasas]

Hola Valentina. Creo que si no te quedó tan claro con el vídeo como tal, no hay tanto que pueda mejorar con un comentario. Sin embargo, siéntete libre de contactarme rápido en redes o por mail. Suelo regalarle 30 min de mi tiempo a todos para intentar explicar algo que no quedó tan claro. ¡Saludos!

[@juanmanuelsantangelo9545]

Cuáles serían esos métodos de extracción de ARN, me gustaría saber para indagar sobre ellos por mi cuenta.

[@BrandonOrtizCasas]

Las técnicas de extracción de RNA son en esencia las mismas que las de DNA (Tryzol, Fenol cloroformo, uso de columnas, etc). Sin embargo, suelen añadir modificaciones para poder aislar RNA lo más intacto posible. Por ejemplo, en las extracciones con RNA se puede añadir desde un principio tiocianato de guanidina para desnaturalizar las RNAsas, ya que como sabemos, el RNA es sumamente inestable y "frágil". También en casos contados donde el DNA pudiera llegar a ser un contaminante importante, se pudiera llegar a utilizar un tratamiento con DNAsas, pero generalmente varios investigadores no lo ven como un paso necesario, ya que utilizan procedimientos que son dependientes únicamente de moléculas de RNA. También, debemos recordar que a diferencia del DNA, el RNA debe utilizarse casi inmediatamente después de que este fue extraído, lo cual es una diferencia importante. O lo metes a ultracongelación, o lo usas al instante.

[@juanmanuelsantangelo9545]

@@BrandonOrtizCasas Te agradezco enormemente el hecho de que hayas tomado un rato de tu tiempo para aclarar mi duda. Me quedó más que claro. Muchas gracias.

[@juanmanuelsantangelo9545]

@@BrandonOrtizCasas Perdón por repreguntar pero es que la curiosidad me mata y siempre quiero llegar a la X de la cuestión, no quiero hacerte perder el tiempo, pero en esos casos en los que no se utiliza DNAsas que métodos se utilizan para separar el RNA del DNA. Puede ser que tenga algo que ver con la menor densidad de las moleculas de RNA lo cual permitiría que queden aisladas del DNA? Es decir, formando parte de fases distintas? Así luego se utilizaría algún otro tipo de alcohol como el isopropanol para precipitar el RNA de la fase acuosa.

[@BrandonOrtizCasas]

​@@juanmanuelsantangelo9545 Aunque quizá puedas encontrarte un par de protocolos en la literatura, la forma más efectiva, segura (y hasta cierto punto, barata) es usar una DNAsa. La mayoría de las veces, no es necesario ni práctico el separar ambas moléculas. En una RT-PCR, no deberías tener problema con DNA genómico si diseñaste bien tus primers. En un Northern Blot, la sonda debe ser específica. Hay muchos cambios después de la transcripcion en la molécula.

[@jacquelinemarchan7364]

Por qué normalmente en la autoradiografía aparecen 3 bandas, una gruesa, otros mediana y la última delgada? No estoy segura si esto es en todos pero en varios casos lo he visto y no he sabido interpretarlo.

[@BrandonOrtizCasas]

Hola Jacqueline. ¿En que partes generalmente? En mi poca experiencia en estas técnicas, no he visto una constante así. Tendría que saber que dicen esas radiografías en concreto, para dar una opinión más clara.

[@yamiletdiaz5512]

Disculpe mi ignorancia, tengo la duda sobre si en este método se usan enzimas de restricción :(

[@BrandonOrtizCasas]

Hola Yamilet. Me parece que no, o al menos la gran mayoría de Northerns no requerirían digestión con enzimas. Un Northern se hace si se requiere evaluar transcritos. Si se quisiera hacer algún análisis con las enzimas (e.g. un RFLP) sería mucho más fácil hacer un Southern.

[@yamiletdiaz5512]

@@BrandonOrtizCasas muchas gracias! ☺

[@yasminaromanheredia5972]

¿Cuáles son los tipos de marcadores que se utilizan?

[@ElianaBalt]

Hola Yasmín. Lo menciona en el video casi al final. Pueden ser de tipo radioactivo (fósforo 32) o con el uso de marcadores indirectos, que emplean sondas (secuencia complementaria a la secuencia de interés) unidas a enzimas (como la peroxidasa de rábano o la avidina). Estas enzimas son capaces de hidrolizar sustratos que generan una señal luminosa. En el caso de la avidina requiere que la sonda usada esté unida a biotina. Saludos!

[@jesuszlatansocrates7332]

Que significa el rastro que deja la migración ..ya finalizado en bandas..acaso es contaminación es una duda

[@BrandonOrtizCasas]

Hola Jesús, siento la tardanza en contestar. Ese efecto de manchado (o "smearing") puede de hecho ser por varias cosas. Puede ser resultado de contaminación, una mala electroforesis (siendo esos residuales del mismo cDNA que no "llegaron" al punto que debían), señales de una mala digestión (donde se cortaron también otros fragmentos de diferentes tamaños pero con menor abundancia) o en casos extremos, inclusive puede ser señal de que las sondas utilizadas no son muy especificas. Incluso pueden ser el resultado de sobrecargar el pozo de un gel cuando lo cargamos. Como parte de la muestra se sale del pozo, y ya sea que se quede afuera o que permé en el gel, puede contribuir al manchado. ¡Saludos!

[@jesuszlatansocrates7332]

@@BrandonOrtizCasas me recomiendas que el gel sea más delgado o más grueso..o que tenga más tiempo la electroforesis ..y gracias por la respuesta

[@jesuszlatansocrates7332]

Disculpa una pregunta más..uno de los cables del tanque de electroforesis se despegó dela base de plástico que va pegado a la pared..afecta en mi procedimiento..ya que desde que pasó esto la migración si se realiza pero no es tan visible como antes .se despegó el positivo..y gracias por tu atención.

[@BrandonOrtizCasas]

Hola de nuevo Jesus. El grosor del gel realmente no tiene una gran relevancia. El gel debe tener el grosor ideal para que los dientes puedan formar los pozos sin problema, y que el gel pueda estar sumergido en el buffer. Si es muy delgado, quizá tu mayor problema sería que no se hagan bien los pozos o que simplemente el gel sea muy frágil y se rompa fácilmente. Si lo haces muy grueso, estarás desperdiciando agarosa, la cual es cara. En tu segundo comentario, creo que no hiciste la pregunta como tal. ¿A qué te refieres con que se despegó el cable del plástico? No sé como sea tu cámara de electroforesis, pero por lo general, los cables están "por separado", mientras que lo único que queda pegado a la cámara son los electrodos. Si en tu caso se despegó el ánodo, quizá eso afecta tu migración, por que quizá no hay suficiente carga para atraer al DNA. Sin embargo, habría que checar bien. Puede ser que tus cables estén algo dañados, o inclusive puede ser que la fuente de poder no funcione bien. Pero ojo. ¿A qué te refieres exactamente con "visible"? Si las bandas están muy pegadas por falta de migración, quizá si sea problema de los electrodos. Pero si las bandas se ven muy tenues, dudo que sea cosa de la migración. Pudiera ser problema de las muestras o incluso del dye.

[@jesuszlatansocrates7332]

@@BrandonOrtizCasas están muy pegadas las bandas. Y del cátodo positivo sale un cable que va pegado a la pared del tanque en el fondo..se despegó y cuando realizó la prueba las bandas quedan muy pegadas..pensé que era el gel red..pero creo que es el tanque..en qué afecta que el cable este despegado..y muchas gracias por tus consejos..soy nuevo en esto

[@aracelirivera5700]

Entonces es así de simple, la densidad de la "mancha" solo está correlacionada con la concentración de RNA 😯

[@BrandonOrtizCasas]

Así de simple. Pero salvo que se use un análisis desométrico, no puede cuantificarse. Solo compararse con otras muestras.

[@visormove]

Si hace un analisis en español

[@cristhianruiz5323]

Tienen el pdf en español

[@BrandonOrtizCasas]

No sé si exista el mismo artículo en español, pero si lo tienes, con gusto compártelo.